مرجع تخصصی آب و فاضلاب

به طور کلی برای شمارش کلی فرم ها در آب سه سری روش قابل انجام است. این روش ها عبارتند از:

- آزمون تخمیر چند لوله ای (multiple-tube ferementation test)

- روش فیلتر غشایی (membrane filter method)

- روش های سوبسترای آنزیمی (enzyme substrate methods)

هر روش مزایا و معایبی دارد و بر این اساس هر یک در مورد نوع و حالت خاصی از نمونه های آبی توصیه می شوند. در ادامه توضیحی کلی در مورد هر یک از این سه سری روش در رابطه با شمارش یا سنجش کلی فرم ها ارایه می شود.

1) در آزمون تخمیر چند لوله ای برای شمارش کلی فرم ها از محیط کشتی استفاده می شود که محتوی قند لاکتوز باشد. نمونه به لوله ها وارد می شود یا اصطلاحاً تلقیح می گردد. لوله ها در دمای مناسب قرار داده می شوند و پس از زمان مناسب نتیجه بررسی و ثبت می شود. این آزمون در حالت معمول برای توتال کلی فرم ها شامل سه مرحله احتمالی، تأییدی و تکمیلی است. تعداد لوله هایی که در آن ها پس از این مراحل حضور کلی فرم نشان داده شود ثبت می شود و بر اساس جدولی خاص و یا استفاده از فرمولی معین تعداد کلی فرم ها (توتال و یا فکال) در هر 100 میلی لیتر نمونه آب تعیین می شود.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

MPN TEST
يكي از روشهاي ازمايش باكتريولوژي اب است .
Most Probable Number
محتملترين تعداد
 
1- مرحله احتمالی
 
1.این مرحله به گونه ای طراحی شده است که ضعیف ترین سلول کلی فرم نیز قادر به رشد باشد .
 
۲.این مرحله در محیط مکانکی برات یا لاکتوز برات که دارای لوله دورهام است انجام می شود. در هر دو محیط  قند لاکتوز وجود دارد عامل انتخابی برای باکتری های کلی فرم میباشد .
 
۳.کدورت محیط و وجود گاز نشان دهنده واکنش مثبت  و وجود باکتری های کلیفرم و احتمال الودگی مدفوعی است کدورت تنها وبدون تشکیل گاز به عنوان واکنش مثبت ارزیابی نمی شود زیرا در این صورت باکتری های رشد کرده اند که قادر به تولید گاز نبوده و کلی فرم محسوب نمی گردند.
 
 
روش كار در مرحله احتمالي :

 

•محيط كشت : لاكتوز براث دو غلظتي و تك غلظتي
•روش : مي تواند به روش 5لوله اي 9 لوله اي و 15 لوله اي باشد
•مقدار انتقال نمونه :10 و  1 و0.1سي سي مي باشد
•مدت زمان ماند : 24 تا 48 ساعت
•دما : 35 تا 37 درجه سانتيگراد در انكوباتور
•بيان نتيجه : در صورت پديد امدن گاز در دورهام و كدورت مثبت تلقي مي گردد

طريقه بيان نتايج :

 
•به دو روش مي باشد
1.از طريق جدول
2.از طريق فرمل توماس

 

2- ازمایش تاییدی
 
1.پس از واکنش مثبت ازمایش  احتمالی انجام می شود .
2.از محیط کشت BGLB استفاده می شود .
3.رنگ برلیانت گرین و اگزال موجود در این محیط کشت از رشد باکتری های غیر کلیفرمی ممانعت می کند .
4.وجود گاز در لوله دورهام نشان دهنده  واکنش مثبت ازمایش تاییدی است .

 

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

از این تست برای تمایز قائل شدن  بین باسیلهای گرم منفی روده به  بویژه اشرشیاکلی و گروه انتروباکتر –کلبسیلا استفاده می شود .
این تست شامل چهار تست مختلف است :
1.Indole Test
2.Methyl red  Test
3.Voges-Proskauer Test
4.Citrate utilization Test
 
Indole Test
 
 
ایندول توسط بعضی از میکروارگانیسم های معین در تریپتون برات تولید می شود . تریپتون برات غنی از اسید امینه تریپتوفان است که توسط این باکتریها به عنوان منبع کربن ونیتروژن و انرژی استفاده می شود .
همه باکتریها و حتی همه باکتریهای روده ای گرم منفی قادر به مصرف تریپتوفان و تولید ایندول با این روش نیستند . بنابراین تولید ایندول می تواند یک روش تشخیص باشد .
 
 
Methyl red Test
 
اساس این تست بر پایه تولید اسید از گلوکز توسط باکتریها است
اشرشیاکلی گلوکز را تخمیر کرده و انواع اسید ها را به عنوان محصول فرعی یا نهایی تولید می می کند
اشرشیاکلی بعد از 48 ساعت رشد PH  محیط رابه5/4 یا کمتر رسانده  بنابراین رنگ متیل رد به قرمز تبدیل می شود

 
Voges-Proskauer Test

 
اساس این تست بر پایه تولید استیل متیل کربونیل (که یک ماده خنثی است ) از گلوکز می باشد .
اشرشیاکلی نمی تواند استیل متیل کربونیل تولید کند در صورتیکه انترو باکتر کلبسیلا می تواند .

 

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

ويژگيهای ميکروبي آب آشاميدني مبنای قضاوت در مورد تعيين قابليت شرب آبها از نقطه نظر بيولوژيکي قرار مي گيرد. البته قضاوت صحيح بدون رعايت ساير جوانب از جمله شرايط و دوره تناوب نمونه برداری، نگهداری نمونه ها و بالاخره دقت در انجام آزمايشها ميسر نخواهد بود.

اصولا آبي که به مصرف آشاميدن مي رسد بايد از ميکروارگانيسم های بيماريزای شناخته شده و همچنين باکتريهای نشانگر که نشانه آلودگي آب با مدفوع است عاری باشد. کليفرمها بهترين باکتری های نشانگر هستند که در آزمايش باکتريولوژيکي آبها مورد توجه قرار مي گيرند.

باکتريهای نشانگر ديگر مانند استرپتوکوکوس های مدفوعي و کلستريديومهای احيا کننده سولفيت نيز مي توانند در تعيين منشا آلودگي آب با مدفوع و ارزشيابي کارآيي روش کلرينه کردن مورد استفاده قرار گيرند.

شمارش کلي باکتريها: شمارش کلي باکتريها در آب دارای اهميت زيادی نيست و بسياری از آبهايي که کاملا سالم هستند ممکن است دارای تعداد زيادی باکتری باشند. بندرت ديده شده که آبي بدون باکتری باشد، ولي ممکن است آب چاههای بسيار عميق تعداد نسبتا کمتری باکتری داشته باشند.

 بطور کلي آب چاههای عميق در مقايسه با آب چاههای کم عمق از کيفيت بهتری برخوردار هستند.

---

دفعات نمونه برداری بمنظور آزمايش باکتريولوژکي

دفعات نمونه برداری و آزمايش نمونه های آب بايد کنترل صحيح کيفيت آب را امکان پذير سازد.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

اتوکلاو

اتوكلاو كه با بخار مخصوص كه طبق دستور كاتالوك استفاده ميشود وبهترين طريق استريل كردن وسايل ميباشد .اين طريقه استريل كردن كليه ميكروب ها اعم از معمولي و اسپور ها را از بين مي برد ومدت زمان آن براي وسايل فلزي وپارچه اي فرق ميكند
طرز بسته بندي كرن وسايل در اتوكلاو    

اصولا وسايلي كه براي استريل كردن آماده مي شوند بايد يك اندازه معين باشد تا استريل شود
بزرگترين اندازه35*40*سانتيمتر بايد سعي شود كه اندازه ان بزرگتر نباشد
وسايل طوري در اتوكلاو باید چيده شود كه بخاربتواند به آساني ازلاي و سايل عبور كند و حتما قسمت داخلي پتكها را نوار اتوكلاو بزنيد كه مطمئن باشيد در موقع مصرف كه نوار آن تغيير رنگ داده ودستكشها را كه مي خواهيد استريل كنيد در پارچه دو لايه ضخيم بپيچيد ومدت زمان ان را مطابق دستور اتوكلاو بگيريد كه معمو لا 15 دقيقه است اگر وسايلي را مي خواهيد در اتوكلاو بگذاريد به روغن آلوده است سعي كنيد ان را پاك كنيد وسپس در اتوكلاو بگذاريد 
معمولا درجه حرارت 250 درجه فارانهايت است زمان ان براي وسايل لاستيكي وسند ها 15 دقيقه است
وبراي وسايل لاستيكي 40 دقيقه براي وسايل فلزي 50 دقيقه معمولا اتوكلاو هاي سريع3 دقيقه اي و دماي آن 250 درجه فارانهايت است البته اين زمان ها براي اتوكلاوهاي مختلف فرق مي كند بايستي در كاتالوگ مدت زما ن دقيق را كنترل كرد سعي كنيد تمام پارچه هايي كه براي پيچيدن پكها به كار برده مي شوددولايه و بدون پارگي وسوراخ باشد.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

ميكروسكوپ و طرز كار آن

هدف: آشنايي با ميكروسكوپ و طرز كار آن در بررسيهاي ميكروسكوبي جانوران ريز ميكروسكوپ دستگاهي است كه براي ديدن اشياء بسيار ريز بكار مي رود. ميكروسكوپ از سه قسمت تشكيل شده است:
1- لوله 2- دسته 3- پايه
لوله ميكروسكوپ حامل دستگاههاي ويژه ديدن است كه توسط دو پيچ يكي بزرگ بنام ماكرومتر و ديگري كوچك بنام ميكرومتر. حركت بطئي لوله با كمك پيچ ميكرومتريك كه يكي از حساسترين قسمتهاي ميكروسكوپ است انجام مي گيرد. در قسمت پايين لوله صفحه مدوري بنام رولور وجود دارد كه در حول محوري مي گردد و بر روي آن عدسيهاي چشمي مختلف نصب شده اند كه به ترتيب مي توانند در مقابل لوله ميكروسكوپ قرار گيرند. لوله از عدسيهاي چشمي و عدسيهاي شيئي تشكيل شده است. اوكولر از دو عدسي كه در دو طرف آن قرار گرفته اند تشكيل شده است و بر حسب قدرت درشت نمايي داراي درجات مختلف ميباشد. در وسط لوله اوكولر سوراخي است بنام ديافراگم اوكولر كه جهت قرار دادن ميكرومتر اوكولر است.
عدسيهاي شيئي از يك سري عدسيهاي مختلف تشكيل شده است كه درون لوله اي قرار گرفته اند. نمرات پايين را عدسيهاي خشك و نمرات بالا را عدسيهاي ايمرسيون مي نامند كه براي ديدن اشياء خيلي ريز بكار مي روند و لازم است از آنها در محيطي با انديس رفراكسيون معيين استفاده كرد. اين محيطها محتوي آب و روغن سدر مي باشند كه روغن سدر متداول بوده و داراي انديس رفراكسيون 52/1 مي باشد. بعضي از ميكروسكوپها بجاي يك اوكولر داراي دو اوكولر مي باشند كه آنها را ميكروسكوپ دو چشمي مي گويند.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

تعریف کشت :
هنگامیکه باکتریها در شرایطی مناسب قرار گیرند که قادر به تکثیر و رشد باشند اصطلاحا گفته می شود باکتری کشت داده شده است .
تعریف محیط کشت :
از آنجا که میکروب یک موجود تک سلولی بوده و قادر است کلیه اعمال حیاتی خود را مستقلا انجام دهد بدون آنکه نیاز به سلول دیگری داشته باشد . این اصل بیانگر آن است که میکروبها هم احتیاج به غذا و آب و موادآلی و معدنی دارند. محیطی مغذی که حاوی کلیه احتیاجات یک میکروب اعم از مواد غذایی و عناصر و غیره باشد که موجب رشد آن میکروب شود را اصطلاحا محیط کشت می گویند.
این محیط کشت می تواند بصورت دست ساز بوده یا یطور طبیعی یعنی داخل سلولهای بدن یک جانور باشد.
خون بهترین محیط برای رشد یک باکتری می باشد جون تمام احتیاجات یک بامتری اعم از اکسیزن ، مواد مغذی ، PH مناسب ، درجه حرارت لازم و غیره را برای یک باکتری فرآهم می کند.
میکروبها را می توان بر روی محیطها و در ظروف مختلف کشت داد که انتخاب شکل بستگی به نوع کشت داد. مثلا در کشتهایی که محیط آن مایع است ظروف کشت لوله ای می باشد و محیطهای جامد(آگاردار) هم در پلیت و هم در لوله کشت داده می شوند.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب

روش رنگ آمیزی گرم
معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.
میکروب شناسی ، بنام کریتستیان گرم در سال 1884 بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.

بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیمتر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.
بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب